| Sumario: | Trichomonas vaginalis es el agente causal de la tricomoniasis, afectando al 12% de
los hombres y al 16% de las mujeres en el mundo. La manifestación clínica más
frecuente es la vulvovaginitis, dolor abdominal y mayor secreción vaginal. Se sabe que
T. vaginalis posee la habilidad de destruir in vitro monocapas celulares de la mucosa
vaginal, donde las fosfolipasas A2 (FLA2) han sido reportadas como posibles factores de
virulencia. En T. vaginalis, estas enzimas están en forma soluble (fracción subcelular
S30), en el medio de cultivo y asociadas a membrana (fracción particulada P30).
Objetivo General. Purificar a homogeneidad una fosfolipasa A2 de T. vaginalis,
caracterizarla parcialmente, obtener su secuencia parcial y determinar su participación
en el efecto lítico de T. vaginalis. Objetivos Específicos. 1) Obtención de la fracción
S30 de T. vaginalis con actividad de FLA2 y determinar condiciones para su
purificación. 2) Elaboración de la columna de afinidad usando Sefarosa-4B activada con
bromuro de cianógeno y el inhibidor de Rosenthal como ligando. 3) Purificación de una
FLA2 soluble de la fracción S30 de T. vaginalis. 4) Obtener la secuencia parcial de la
FLA2 purificada a homogeneidad mediante espectrometría de masas en tandem acoplada
a cromatografía de líquidos de alta resolución. 5) Caracterizar parcialmente la enzima
pura en cuanto a tiempo de incubación, curvas dosis-respuesta, pH óptimo de actividad y
dependencia de calcio. 6) Determinar la participación de la enzima pura en la actividad
lítica de T. vaginalis usando el inhibidor de Rosenthal. Material y Métodos. Utilizamos
la cepa GT-15 de T. vaginalis la cual cultivamos en medio PEHPS. Obtuvimos la
fracción subcelular (S30) a partir del cultivo masivo para purificar a partir de ella una
fosfolipasa A2 soluble. La detección y cuantificación de la actividad de FLA2 en el
extracto S30, previo a la purificación y posterior a ella se hizo por el método de
radioensayo descrito por Vargas-Villarreal et al., (1995). La fosfolipasa A2 se purificó
mediante cromatografía de afinidad, la cual tuvo como ligando al inhibidor de Rosenthal
que en presencia de calcio retiene a las fosfolipasas A2 mediante la interacción
específica enzima-sustrato. La elución de las fosfolipasas A2 de la columna se hizo
mediante la remoción del calcio. Una vez la enzima ya purificada, se caracterizó
parcialmente. Se determinó el peso molecular el cual fue de aproximadamente 13 KDa,
se obtuvieron secuencias parciales, se determinó el pH óptimo de actividad que fue de
6.0, concentración óptima de calcio en 1 mM, tiempo óptimo de incubación a una hora y
se determinó su efecto hemolítico sobre eritrocitos de rata el cual fue del 100 % a la hora
de incubación con una actividad hemolítica directa.
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