| Sumario: | Propósito y Método del Estudio: El objetivo del presente estudio fue el de ampliar la
aplicación de dos sistemas de expresión/purificación nobel, CusF/E. coli y SmbP/E. coli.
Una serie de estrategias avanzadas en biología molecular fueron empleadas para dicho
fin, incluyendo la modificación del gen de cusF generando un mutante con mayor
afinidad a Ni(II), el uso de péptidos señal para señalización Tat y la modificación directa
del genoma de E. coli para generar un sistema de expresión libre de plásmido acoplado
a SmbP.
Contribuciones y conclusiones: Se obtuvo la proteína de fusión CusF3H+, la cual es
una variante mejorada de CusF permitiendo obtener niveles de pureza mayores al 70%
en un solo paso, estando a la par de otras proteínas de fusión en el mercado. Se
obtuvieron cuatro plásmidos modificados a partir del pz8-ptac para la obtención de
proteínas marcadas con SmbP y CusF3H+ en C. glutamicum utilizando dos péptidos
señales de naturaleza Tat, TorA de E. coli y CgR_0949 de C. glutamicum. Con ambos
péptidos señal, la proteína GFP marcada con SmbP y CusF fue secretada al medio
sobrenadante y purificada mediante IMAC. Mediante la técnica de CRISPR/Cas9 se
logró realizar la deleción del gen cueO para la inserción de un casete con el conjunto de
SmbP-GFP, así como el promotor, 5´-UTR y 3´-UTR de la proteína de choque frio CspA
(para realizar la inducción por cambios de temperatura) y los dos brazos de homología
rio arriba y rio abajo a cueO en el genoma de E. coli. Obteniendo así el mutante de E.
coli MG1655ΔcueO::smbp-gfp.
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