| Sumario: | Los organismos monitorean una serie de señales internas y externas para ajustar su comportamiento frente a diferentes entornos. Las proteínas encargadas de la transducción de señales son llamadas proteínas sensoriales, y éstas contienen dominios sensoriales que son sensibles a las señales tales como la absorción de la luz o la unión de una sustancia química o ligando; y dominios de respuesta que poseen actividad biológica. Algunas proteínas sensoriales contienen dominios Per-‐ARNT-‐Sim(PAS), estos dominios son relativamente pequeños, de aproximadamente 110 aminoácidos y han sido reportados en todos los reinos de la vida. En proteínas, un dominio se caracteriza por una secuencia de aminoácidos específica, sin embargo, los dominios PAS difieren de esta definición, pero sí se caracterizan por poseer una estructura definida que consta de cinco plegamientos beta antiparalelos flanqueados por varias alfa hélices cuya estructura les permite detectar cambios físicos y químicos. Estos dominios pueden activar diferentes dominios de respuesta, que en bacterias incluyen a fosfatasa e histidina quinasa. Se planteó la siguiente hipótesis: El dominio Per-‐ARNT-‐Sim(PAS) de RsbP es capaz de interactuar con distintos dominios derespuesta, ya sea fosfatasa o histidina quinasa formando estructuras cuaternarias definidas. El objetivo general es: Establecer la relación estructura-‐función de dominios PAS bacterianos determinando interacciones específicas con distintos dominios de respuesta. La metodología incluye las técnicas de clonación tradicionales, expresión y purificación de proteínas por medio de cromatografía por afinidad y por intercambio aniónico
y finalmente el estudio del estado oligomérico por medio de cromatografía de exclusión. Contribuciones y Conclusiones: en el
presente estudio se expresó, purificó y caracterizó el dominio sensorial PAS de RsbP (RsbP-‐PAS) y la proteína completa RsbP de
B. subtilis. Estas proteínas seexpresaron y purificaron utilizando la proteína glutatión S-‐transferasa (GST) como proteína de
fusión. Mediante cromatografía de exclusión por tamaño se determinó la estructura cuaternaria del dominio sensorial PAS de RsbP
siendo un monómero y la proteína completa RsbP como tetrámero. Además en este estudio se llevó a cabo la construcción de dos
proteínas quiméricas de RsbP. La primera esta compuesta de la siguiente manera, (RsbP-‐PAS) como domino sensorial, bucle enrollado, el cual conecta al domino sensorial con el dominio de respuesta, e histidina quinasa (PAS-‐HPK) como dominio de respuesta; y la
segunda, (RsbP-‐PAS) como domino sensorial, el primer dominio PAS del fitocromo A que conecta ambos dominios y fosfatasa como dominio de respuesta (PAS-‐PASalt-‐PPM). Estas proteínas se expresaron utilizando la proteína glutatión S-‐transferasa como proteína de fusión la cual permite la purificación por afinidad. En el caso de PAS-‐HPK se obtuvo suficiente proteína soluble, sin embargo,PAS-‐PASalt-‐HPK mostró la presencia de cuerpos de inclusión los cuales disminuyen el rendimiento de proteína soluble y dificultansu purificación.
Es
importante
señalar
que
en
estudios
posteriores
se
mejorará
la
obtención
de
proteína
soluble
de
las
proteínas
quiméricas,
para
mejorar
sus
rendimientos
de
purificación
y
su
caracterización
y
de
esta
manera
conocer
el
estado
oligomérico
que
éstas
presentan;
para
corroborar
la
teoría
que
el
dominio
PAS
puede
activar
diferentes
dominios
de
respuesta
ya
sea
con
la
presencia
del
bucle
enrollado
y/o
la
presencia
de
dominios
PAS
alternos;
y
posteriormente
determinar
los
mecanismos
de
transducción
de
señales
que
estos
dominios
presentan.
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