Aislamiento y caracterización parcial de una Fosfolipasa A2 de Trichomonas vaginalis - Escobedo Guajardo, Brenda Leticia (2012)
Trichomonas vaginalis es el agente causal de la tricomoniasis, afectando al 12% de los hombres y al 16% de las mujeres en el mundo. La manifestación clínica más frecuente es la vulvovaginitis, dolor abdominal y mayor secreción vaginal. Se sabe que T. vaginalis posee la habilidad de destruir in vitro monocapas celulares de la mucosa vaginal, donde las fosfolipasas A2 (FLA2) han sido reportadas como posibles factores de virulencia. En T. vaginalis, estas enzimas están en forma soluble (fracción subcelular S30), en el medio de cultivo y asociadas a membrana (fracción particulada P30). Objetivo General. Purificar a homogeneidad una fosfolipasa A2 de T. vaginalis, caracterizarla parcialmente, obtener su secuencia parcial y determinar su participación en el efecto lítico de T. vaginalis. Objetivos Específicos. 1) Obtención de la fracción S30 de T. vaginalis con actividad de FLA2 y determinar condiciones para su purificación. 2) Elaboración de la columna de afinidad usando Sefarosa-4B activada con bromuro de cianógeno y el inhibidor de Rosenthal como ligando. 3) Purificación de una FLA2 soluble de la fracción S30 de T. vaginalis. 4) Obtener la secuencia parcial de la FLA2 purificada a homogeneidad mediante espectrometría de masas en tandem acoplada a cromatografía de líquidos de alta resolución. 5) Caracterizar parcialmente la enzima pura en cuanto a tiempo de incubación, curvas dosis-respuesta, pH óptimo de actividad y dependencia de calcio. 6) Determinar la participación de la enzima pura en la actividad lítica de T. vaginalis usando el inhibidor de Rosenthal. Material y Métodos. Utilizamos la cepa GT-15 de T. vaginalis la cual cultivamos en medio PEHPS. Obtuvimos la fracción subcelular (S30) a partir del cultivo masivo para purificar a partir de ella una fosfolipasa A2 soluble. La detección y cuantificación de la actividad de FLA2 en el extracto S30, previo a la purificación y posterior a ella se hizo por el método de radioensayo descrito por Vargas-Villarreal et al., (1995). La fosfolipasa A2 se purificó mediante cromatografía de afinidad, la cual tuvo como ligando al inhibidor de Rosenthal que en presencia de calcio retiene a las fosfolipasas A2 mediante la interacción específica enzima-sustrato. La elución de las fosfolipasas A2 de la columna se hizo mediante la remoción del calcio. Una vez la enzima ya purificada, se caracterizó parcialmente. Se determinó el peso molecular el cual fue de aproximadamente 13 KDa, se obtuvieron secuencias parciales, se determinó el pH óptimo de actividad que fue de 6.0, concentración óptima de calcio en 1 mM, tiempo óptimo de incubación a una hora y se determinó su efecto hemolítico sobre eritrocitos de rata el cual fue del 100 % a la hora de incubación con una actividad hemolítica directa.