Fármacos epigenéticos con efecto en la actividad promotora del gen rb1 en células hepáticas humanas - Vargas Gómez, Jorge Eduardo (2019)
El gen RB1 es un gen supresor de tumores que se encuentra reprimido en el carcinoma hepatocelular. Previamente, se observó que los niveles de mRNA del gen RB1 se incrementan por efecto de dos fármacos epigenéticos isotretinoina y talidomida, en la línea celular HepG2. En la presente tesis se analizó el efecto de estos fármacos sobre la región promotora del gen RB1 en las líneas celulares de cáncer hepático HepG2 y Huh-7. La evaluación de la actividad promotora de RB1 se realizó a través de un sistema de vectores plasmídicos conteniendo al promotor fusionado al gen reportero de luciferasa (construcción pGL4-RB1). Los plásmidos se transfectaron en las líneas celulares mediante lipofección. Una vez transfectadas, las células fueron expuestas a fármacos moduladores de la epigenética a diferentes concentraciones y periodos de tiempo, y se determinó la actividad de luciferasa. Por otro lado, para la determinación de los niveles de metilación en el promotor de RB1, se llevó a cabo el ensayo de secuenciación por bisulfito de sodio, empleando el DNA genómico de las células HepG2 que fueron tratadas con el fármaco isotretinoina, para después realizar la conversión por bisulfito. Luego de la conversión, se realizó la amplificación del promotor mínimo de RB1, y el fragmento amplificado se subclonó en un vector comercial para el análisis de metilación por secuenciación automatizada. Los resultados obtenidos muestran un incremento de 13.55% y 25% de la actividad promotora del gen RB1 por efecto del fármaco isotretinoina a las concentraciones de 5 y 10 µM en la línea celular HepG2 a las 24 h. A las 48 h a una concentración de 10 µM, la actividad del promotor disminuyó 39% en las células HepG2 y 44% en la línea celular Huh-7 (24 h). No se observó una diferencia significativa en la actividad del promotor RB1 en presencia del fármaco talidomida en ninguno de los ensayos realizados en las dos líneas celulares. En el perfil de metilación del promotor de RB1, no se observó una diferencia significativa en el porcentaje de metilación de las islas CpG en presencia de isotretinoina en las células HepG2. Nuestros resultados sugieren que el fármaco isotretinoina es capaz de incrementar la actividad del promotor de RB1 en células hepáticas, pero no a través de la modificación del porcentaje de metilación en la región promotora.