Interacciones triméricas del complejo Antp-TBP con los factores TFIIEβ, BIP2 y la homeoproteína Exd - Jiménez Mejía, Gustavo (2018)
Las homeoproteínas son factores transcripcionales altamente conservados, cuya principal función es determinar la identidad en el plan corporal de los organismos. Estas poseen un dominio conservado de 60 aminoácidos conocido como homeodominio (HD), mediante el cual reconoce secuencias ricas en TA ampliamente distribuidas en el DNA. Antennapedia (Antp) es una homeoproteína de Drosophila melanogaster que además de su unión al DNA presenta interacción con otras proteínas para llevar a cabo su función. Interacciones moleculares proteína-proteína de Antp han mostrado su interacciona con el factor transcripcional TBP a través de la región rica en glutaminas de ambas proteínas y abren la posibilidad de que sea mediada por un tercer elemento. Debido a lo anterior en esta tesis se determinaron las interacciones triméricas de Antp-TBP con los factores TFIIEȕ, BIP2 y la homeoproteína Exd. La estrategia experimental consistió en analizar las interacciones triméricas usando el sistema de Transferencia de Energía por Resonancia basado en la Complementación Bimolecular Fluorescente (FRET/BiFC). Para ello, se estandarizó el sistema FRET/BiFC con la detección de la interacción trimérica Jun-Fosp65 usando un 10% de potencia de los láseres, 200nm de apertura confocal, 0% de offset y 1x de ganancia. Las interacciones obtenidas fueron analizadas en el software de uso libre ImageJ utilizando el plug-in FRETTY. Para determinar las interacciones trimérica de Antp-TBP con los factores transcripcionales, se construyeron los plásmidos pECFP-N1- TFIIEȕ, pECFP-N1-BIP2 y pECFP-N1-Exd, los cuales se cotransfectaron con los plásmidos codificantes a VCAntp y VNTBP. Los resultados obtenidos usando el sistema FRET/BiFC mostraron exitosamente en las células transfectadas la formación de los tres complejos triméricos Antp-TBP/TFIIEȕ, Antp-TBP/BIP2 y Antp-TBP/Exd con valores de transferencia de energía correspondientes a E=0.50±0.05, E=0.15±0.03 y E=0.43±0.18, respectivamente. La formación de los complejos triméricos con factores transcripcionales juegan un papel importante en la regulación de la transcripción además de brindar especificidad en los sitios de unión al DNA, por lo que la presencia de interacciones triméricas de Antp-TBP con los factores transcripcionales TFIIEȕ, BIP2 y Exd en el interactoma de Antp, mostradas en esta tesis, abren la posibilidad de analizar su efecto funcional en la regulación génica en un modelo in vivo en D. melanogaster. ABSTRACT Homeoproteins are highly conserved transcriptional factors whose principal function is to determine the segment identity in the body plan of the organisms. They have a 60 aminoacids domain better known as homeodomain (HD) that recognizes TA-rich sequences widely distributed in the DNA. Antennapedia (Antp) is a D. melanogaster homeoprotein that interact directly with DNA as well as another transcriptional factors to carry out its function. Previous reports had demonstrated that the glutamine-rich regions in Antp and TBP are important in the establishment of their interaction, but the absence of these regions doesn’t abolish completely their interaction, leading the hypothesis that exist a third element mediating this interaction. Due to the above, this thesis proposed to determine if trimeric interactions occur between Antp-TBP and TFIIEB/BIP2/Exd by using a BiFC-based FRET approach. For this purpose, the BiFC/FRET system was standarized with the previous reported trimeric interaction Jun-Fos-p65. Then, we demonstrated that the transcriptional factor TFIIEȕ, BIP2 and Exd form ternary complexes with Antp-TBP through the cotransfection of recombinant plasmids bearing the coding sequences of TFIIEȕ, BIP2 and Exd fused to ECFP and the coding sequences of VCAntp and VNTBP. The results were analyzed with the free using software ImageJ and the plug-in FRETTY and evidenced the formation of the trimeric complexes AntpTBP-TFIIEȕ (E=0.50±0.05), Antp-TBP-BIP21-89(E=0.15±0.03) y Antp-TBP-Exd144-376 (E=0.43±0.18) with FRET/BiFC. According to the results obtained in this work, the evidence of trimeric interactions of Antp-TBP with TFIIEȕ, BIP2 and Exd open the possibility of analyze the functional effect in the genetic regulation in vivo in D. melanogaster.