Diseño y evaluación in vitro de un implante bifásico bioactivo para la reparación de defectos osteocondrales. - Moncada Saucedo, Nidia Karina (2019)
RESUMEN: M.C. Nidia Karina Moncada Saucedo Fecha de Graduación: julio de 2019 Universidad Autónoma de Nuevo León, Facultad de Medicina Candidato para el grado de Doctoren Ciencias con orientación en Biología Molecular e Ingeniería Genética Título del Estudio: Diseño y evaluación in vitro de un implante bifásico bioactivo para la reparación de defectos osteocondrales Área de Estudio: Ingeniería Tisular Número de páginas: 130 INTRODUCCIÓN: Las lesiones del tejido osteocondral frecuentemente conducen a una incapacidad, lo que genera un problema de alto costo para el sector salud. Un abordaje actual para solucionar este problema es la ingeniería tisular, mediante la construcción de implantes osteocondrales biomiméticos que permitan la síntesis de proteínas propias de la matriz y con propiedades biomecánicas similares al tejido nativo. En este trabajo se diseñó, construyó y caracterizó in vitro un nuevo implante bifásico, biomimético y bioactivo basado en tres biomateriales: matriz de cartílago bovino (MCB) y fibroína de seda (FS) para mimetizar el cartílago, y matriz de hueso bovino (MHB) para mimetizar el hueso subcondral. OBJETIVO: Diseñar y construir un nuevo andamio bifásico, biomimético y bioactivo a partir de MCB/FS-MHB para la reparación de defectos osteocondrales y evaluar in vitro sus propiedades biológicas. MÉTODOS: Se descelularizó la MCB con SDS y/o buffers hipotónicos y la MHB con peróxido de hidrógeno. Se generaron tres grupos experimentales de andamios bifásicos con diferentes proporciones de NaCl (como porógeno) y MCB, además de un grupo sin MCB. Se caracterizó su microestructura por microscopia electrónica de barrido (MEB) y microtomografía computarizada (micro-CT). Se aislaron células madre derivadas de tejido adiposo humanas (hADSCs) y se cultivaron en medio xeno-free, se caracterizó su inmunofenotipo por citometría de flujo y su capacidad multipotencia por histologías (rojo de alizarina, azul de Alcian y rojo oleoso). Se cultivaron en monocapa con o sin medio condrogénico y se sembraron en el andamio. Se evaluó su capacidad de adhesión celular (después de 7 días de cultivo) en el andamio por MEB y su proliferación celular (después de 15 días de cultivo) con azul alamar; además de su capacidad para producir matriz de novo por histologías (tricrómico de Masson, H&E, safranina O, azul de toluidina, rojo de picrosirio) e inmunohistoquímicas (COL I, COL II y AGC). Se evaluó la influencia del microambiente en la expresión génica por qRT-PCR (al día 14 de cultivo) para COL I, COL II, COL X, AGC, PA, SOX-9, RUNX-2. RESULTADOS: La MCB mostró una descelularización del 91.6%, una conservación de fibras de colágeno del 86%, 58.23% de agrecano y 49.4% de COL II. Se logró el ensamblaje del andamio bifásico con una metodología reproducible, donde la porosidad total fue de 75% para la fase de “cartílago” y 76% para la fase de “hueso”. Las hADSCs aisladas mostraron un inmunofenotipo característico (CD105+, CD90+, CD73+, CD44+, CD14- CD45-, HLA-ABC+ y HLA-DR-) y capacidad de diferenciación al linaje condrogénico, osteogénico y adipogénico. Las hADSCs mostraron capacidad de adhesión y proliferación celular en el andamio, además de producción de matriz de novo que expresaba COL II y AGC. A pesar de que no hubo diferencias significativas a nivel mensajero, la presencia de la MHB regula a la baja la expresión de marcadores osteogénicos para la fase de “hueso” y potencia la expresión de COL II. CONCLUSIÓN: Se generó un nuevo modelo de implante bifásico biomimético y bioactivo de tres componentes (MCB/FS-MHB) con una metodología altamente reproducible, el cual provee un entorno temporal que ayuda a la infiltración, adhesión, proliferación y diferenciación de hADSCs que son capaces de expresar marcadores condrogénicos, incluso sin estímulo químico; produciendo una MEC con presencia de COL II, para su aplicación en la regeneración de lesiones osteocondrales.