Aislamiento y selección de cepas mutantes de Hirsutella citriformis inducidas por el agente químico: metanosulfonato de etilo (EMS). - Cruz Juárez, Georgina (2017)
Hirsutella citriformis es un hongo entomopatógeno que tiene potencial para desarrollarse como agente de control del liviido Diaphorina citri Kuwayama, vector de la enfermedad más devastadora conocida como Huanglongbing (HLB) ya que causa la muerte productiva de las plantas citrícolas, una vez infectadas. Sin embargo, el hongo tiene un lento crecimiento y reducida producción de conidios. Se tiene la hipótesis que la mutagénesis al azar resultaría en un mejoramiento de tales las características. Por lo cual en el presente trabajo se evaluaron 8 cepas de Hirsutella citriformis para conocer sus características de producción de conidios, velocidad de germinación y crecimiento radial. También se verificó el número de núcleos presentes en la cepa INIFAP-Hir-2.con la finalidad de elegir una cepa candidata para el mejoramiento genético. Se evaluaron técnicas como el cultivo bifásico en diferentes sustratos de bajo costo (sorgo, arroz y avena) para obtener la mayor producción de conidios que serían utilizados en la mutagenesis clásica con el agente químico metanosulfonato de etilo (EMS) el cual ha sido exitosamente usado para introducir cambios de una sola base en el ADN, se estableció un protocolo de mutación variando tiempos y concentraciones para la obtención de cepas mutantes, se caracterizaron las cepas mutantes obtenidas en base a crecimiento radial, producción de conidios y velocidad de germinación en medio PDA con extracto de levadura. Se realizó la técnica de microcultivo para conocer la estructura fúngica de las cepas seleccionadas, se llevaron a cabo bioensayos por contacto contra liviidos de Diaphorina citri para determinar mortalidad. Por otra parte se evaluaron 6 medios líquidos con diferentes concentraciones de carbón y diferentes proporciones de Carbón-Nitrógeno utilizando fuentes de nitrógeno de bajo costo para obtener una alta producción de biomasa y elaborar formulados secos utilizando como soporte 9 diferentes arcillas. Dentro de los resultados obtenidos, el análisis estadístico determinó que las cepas INIFAP-Hir-2, IB-Hir-1 e INIFAP-Hir-5 presentaron significativamente la mayor tasa de crecimiento radial, mostrando valores de 3.63, 3.67 y 3.60 cm respectivamente, a los 50 días en PDA. La tasa de crecimiento radial varió de 0.057 cm /día (IB-Hir-2) a 0.073 cm /día (INIFAP-Hir-2) en medio PDA, mientras que en medio PDAY al 0.5% varió de 0.084 (INIFAP-Hir-4) a 0.1cm/día (INIFAP-Hir-2, INIFAP-Hir-6). A las 5 semanas de incubación se observó que la cepa INIFAP-Hir-2 presentó la mayor producción de conidios y difirió significativamente del resto de las cepas. La cepa INIFAP-Hir-2 a las 48 horas alcanzó 95% de germinación en el medio PDA y se identificó como mononucleada. En la producción de cultivo bifásico, la mayor concentración de conidios se obtuvo con la cepa IB-Hir-2 con el sustrato avena con 9.33x106 conidios g-1 siguiéndole INIFAP-Hir-2 con 8.58x106 , no existiendo diferencia significativa entre los dos valores. La cepa INIFAP-Hir-2 fue la seleccionada para mutación en base a sus características de producción de conidios y tasa de crecimiento radial. En experimentos de producción de conidios en avena y arroz, la avena promovió significativamente mayor producción de conidios que el arroz, y en cuanto al recipiente, fue mejor el de plástico que el vidrio, con una producción de 52.76 x106 conidios/g a los 28 días. Respecto a la mutagénesis, la selección fue en base a su supervivencia, obteniéndose un total de 63 colonias. Las mutantes mostraron fenotipos diversos así como variaciones en las características morfológicas. Las cepas 103-15, 103-17, 101-19, 101-21, 101-23 y 51-11 mostraron diferencias significativas respecto a la mutante 53-10 y al control. La cepa 53-10 produjo 7.61x106 conidios/ml por lo cual mostró diferencia significativa respecto a la cepa silvestre con una producción de 3.05x106 conidios/ml a las seis semanas de incubación en caja Petri en medio de cultivo PDAY 1%. En cuanto a los resultados de velocidad de germinación, a las 24 horas se observó que la cepa mutante 53-10 mostró diferencia significativa respecto a las tres cepas mutadas restantes y diferencia parcial respecto a la cepa silvestre. Las cepas mutantes que produjeron mayor número de conidios sobre agar fueron posteriormente evaluadas en el sustrato avena. A los 14 días se observó diferencia significativa en la producción de conidios entre la cepa mutante 53-10 que presentó 1.95x106 conidios/ml respecto a la cepa silvestre (1.36 x106 conidios/ml). Cuando se realizaron microcultivos, se encontró diferencia significativa en el diámetro de los conidios formados por las cepas mutantes 101-11, 53-10 y 51-6 respecto a la cepa silvestre y la cepa 103-9. Los resultados obtenidos en el bioensayo, al noveno día en nuestro estudio mostró 84% y 98% de mortalidad para la cepa silvestre y mutante 53-10 respectivamente. El efecto de la mutagénesis mostró variaciones en las características morfológicas y fisiológicas de la cepa silvestre INIFAP-Hir-2. La cepa 53-10 mostró mejoramiento en producción de conidios, comparada con la cepa silvestre sin afectar la patogenicidad sobre el insecto. Respecto a la elaboración de formulados, al séptimo día de la inoculación en el medio suplementado con glucosa a una concentración de 36 g/L y casaminoácidos con una relación 10:1 mostró los mejores rendimientos de biomasa con una producción de 19.47 g/L, estadísticamente fue el único medio con mejor rendimiento que los demás. La mayor concentración de peso seco se obtuvo cuando se utilizó como fuente de nitrógeno la harina de semilla de algodón (51.30 g/L) y harina de soya (48.40 g/L), los cuales mostraron diferencia significativa respecto a los medios suplementados con casaminoácidos, extracto de levadura y polvo de remojo de maíz. Se evaluó posteriormente la viabilidad en 9 diferentes arcillas, a las 24 horas se observaron diferencias significativas, el resultado sugiere que el tipo de arcilla influyó en el crecimiento y actividad del hongo. La sobrevivencia de la cepa después de ser secada por aire (<5% humedad) en tierra de diatomeas (Hyflo) mostró una viabilidad de 94% a los 6 días de evaluación y una producción de 1.78x107 conidios g-1 a los 12 días de su inoculación siendo la concentración más elevada obtenida en nuestro estudio. Los resultados mostrados son importantes, ya que el hongo es de lento crecimiento y si se puede lograr rendimientos altos de biomasa en corto tiempo, posteriormente se podrán inocular sustratos sólidos para obtener buena esporulación también en corto tiempo. ABSTRACT Hirsutella citriformis Speare is an entomopathogenic fungus that has the potential to develop as a control agent for Diaphorina citri Kuwayama, vector of the most devastating disease known as Huanglongbing (HLB) which causes the productive death of citrus plants once infected. However, the fungus has slow growth and reduced production of conidia. It is hypothesized that random mutagenesis would result in an improvement of such characteristics. Therefore, in the present work eight strains of Hirsutella citriformis were evaluated to determine their characteristics of conidia production, germination rate and radial growth. Also was verified the number of nuclei, with the purpose of choosing a candidate strain for genetic improvement, in the INIFAPHir-2 strain. Techniques such as biphasic culture on different low-cost substrates (sorghum, rice and oats) were evaluated to obtain the highest conidia production that would be used in classical mutagenesis with the chemical agent ethyl methane sulfonate (EMS) which has been successfully used to introduce changes of a single base in the DNA, a mutation protocol was established varying times and concentrations for the obtaining of mutant strains, which were characterized based on radial growth, production of conidia and speed of germination in media as PDA and PDA with yeast extract. The microculture technique was used to know the fungal structure of the selected strains, and contact bioassays were carried out against Diaphorina citri adults to determine mortality. On the other hand, 6 liquid media with different concentrations of coal and different proportions of Coal-Nitrogen were evaluated using low-cost nitrogen sources to obtain a high biomass production and to formulate dry formulations using different clays as support. Statistical analysis showed that the INIFAP-Hir-2, IB-Hir-1 and INIFAP-Hir-5 strains showed the highest radial growth rate, showing values of 3.63, 3.67 and 3.60 cm respectively , at 50 days incubation in PDA The radial growth rate ranged from 0.057 cm / day (IB-Hir-2) to 0.073 cm / day (INIFAP-Hir-2) in PDA medium, whereas in 0.5% PDAY medium was 0.084 (INIFAP-Hir-4) at 0.1cm / day (INIFAP-Hir-2, INIFAP-Hir-6). At 5 weeks of incubation, the INIFAP-Hir-2 strain showed the highest conidia production and differed significantly from the rest of the strains. The INIFAP-Hir-2 strain at 48 hours reached 95% germination in the PDA medium and was identified as mononucleate. In the bifasic culture, the highest concentration of conidia was obtained with the IB-Hir-2 strain on oats substrate with 9.33x106 conidia g-1, followed by INIFAP-Hir-2 with 8.58x106 , and there was no significant difference between the two values. In experiments on conidia production in oats and rice, oats promoted significantly more conidia production than rice, and as for the container, plastic was better than glass, with a production of 52.76 x 106 conidia / g at 28 days The INIFAP-Hir-2 strain was selected for mutation based on its conidia production and radial growth rate characteristics. Regarding the mutagenesis, the selection was based on its survival, obtaining a total of 63 colonies.The mutants showed different phenotypes as well as variations in morphological characteristics. Strains 103- 15, 103-17, 101-19, 101-21, 101-23 and 51-11 showed significant differences with respect to mutant 53-10 and control. Strain 53-10 produced 7.61x106 conidia / ml showing a significant difference with respect to the wild strain with a production of 3.05x106 conidia/ml at six weeks of incubation in Petri dish in 1% PDAY culture medium. Regarding the results of germination speed, at 24 hours was observed that the mutant strain 53-10 showed significant difference with respect to the three remaining mutated strains and partial difference with respect to the wild strain. The mutant strains that produced the highest number of conidia on agar were subsequently evaluated on the oat substrate. When microcultures were carried out, a significant difference was found in the diameter of the conidia formed by the mutant strains 101-11, 53-10 and 51-6 with respect to the wild strain and the strain 103-9. The results obtained in the bioassay, on the ninth day in our study, showed 84% and 98% mortality for the wild and mutant strain 53-10 respectively. The effect of mutagenesis showed variations in the morphological and physiological characteristics of the wild-type strain INIFAP-Hir-2. Strain 53-10 showed improvement in conidia production compared to the wild strain without affecting the pathogenicity on the insect. With respect to dry weight obtained in liquid media, on the seventh day of inoculation in the medium supplemented with glucose at concentration of 36 g / L and casamino acids with a ratio of 10: 1 showed the best yields of biomass with a production of 19.47 g / L, statistically was the only medium with better performance than the others. The highest dry weight concentration was obtained when cottonseed flour (51.30 g / L) and soybean meal (48.40 g / L) were used as the nitrogen source, which showed a significant difference with respect to the medium supplemented with casamino acids, yeast extract and corn steep powder. The viability of culture was evaluated in 9 different clays, at 24 hours significant differences were observed, the result suggests that the clay type influenced the growth and fungus activity. The survival of the strain after being air-dried (<5% moisture) in diatomaceous earth (Hyflo) showed a viability of 94 % at 6 days of evaluation and a production of 1.78x107 conidia .g-1 at 12 days of its inoculation being the highest concentration obtained in our study. The results shown are important, since the fungus is slow growing and if high yields of biomass can be achieved in a short time, then solid substrates can be inoculated to obtain good sporulation also in a short time.