Análisis del mecanismo de muerte celular inducido por nanopartículas de oro recubiertas con quitosano en células leucémicas K562 y CEM: implicación de las especies reactivas de oxígeno. - Lorenzo Anota, Helen Yarimet (2018)
La leucemia es un serio problema de salud a nivel mundial. Actualmente, las terapias convencionales afectan a células normales causando resistencia al tratamiento; por lo tanto, es necesario el desarrollo de nuevas terapias que puedan ser específicas para las células cancerosas y evitar la resistencia a la muerte celular por la inducción simultánea de diversas vías de muerte. Estudios recientes demuestran que tanto las nanopartículas de oro (AuNPs) como el quitosano tienen actividades biológicas interesantes que incluyen posibles efectos antitumorales. En este estudio, se analizó el mecanismo de muerte celular regulada (MCR), que inducen las nanopartículas de oro recubiertas con quitosano (AuNPs-Qts) en células leucémicas (K562 y CEM). Para ello, se sintetizaron AuNPs-Qts por el método de Turkevich. La muerte celular se evaluó por citometría de flujo, midiendo la exposición de fosfatidilserina y la permeabilidad de la membrana plasmática en células leucémicas y células mononucleares de sangre periférica (PBMC), como control sano no tumoral. La generación de ROS se midió utilizando DCFDA y en presencia del antioxidante N-acetilcisteína (NAC) como un inhibidor de ROS. Para analizar el daño mitocondrial se midió la pérdida del potencial de membrana mitocondrial mediante TMRE y el daño nuclear mediante el estudio de ϒ-H2AX, p53 y el análisis del ciclo celular. Para evaluar el efecto de las ROS en diferentes mecanismos de MCR, primero se analizó la formación de autofagosomas y se utilizó la spautina-1 para analizar la dependencia de autofagia; la activación de la caspasa efectora 3 y el Q-VD-OPH para analizar la dependencia de la apoptosis; y a la necrostatina-1 para analizar la dependencia de necroptosis. Los resultados obtenidos indican que las AuNPs-Qts inducen MCR dependiente de concentración en células leucémicas, mientras que muestran baja toxicidad en PBMC. Además, inducen la producción de ROS que generan daño mitocondrial y nuclear; induciendo MCR dependiente de ROS. Finalmente, los resultados demuestran que la MCR inducida por AuNPs-Qts en líneas celulares leucémicas es dependiente de la línea celular; induciendo apoptosis en células CEM y necroptosis en células K562. Estos resultados abren las puertas a próximos estudios que permitan probar su efectividad in vivo, además de la posibilidad de acoplar a las AuNPs-Qts con agentes que permitan abarcar más tipos de MCR, evitando así la resistencia de las células cancerosas al tratamiento. ABSTRACT Leukemia represent a serious health problem around the world. Currently, the available treatments present the disadvantages of affecting normal cells, and promoting treatment resistance. Therefore, the development of new therapies that can be specific to cancer cells and capable to avoid cell death resistance is needed. Recent studies show that both gold nanoparticles (AuNPs) and chitosan have interesting biological activities including potential antitumor effects. For this thesis, I synthetized chitosan-capped gold nanoparticles (AuNPs-Qts) by a chemical method (Turkevich), and analyzed their capacity to induce cell death in leukemic (K562 and CEM) and non-cancerous cells (PBMC). Cell death was measurement by the analysis of phosphatidylserine exposure, and plasma membrane permeabilization. ROS generation was measured using DCFDA and the antioxidant N-Acetyl Cystein (NAC) as a ROS inhibitor. Mitochondrial and nuclear damage were measured using TMRE and ϒ-H2AX, p53 and the cell cycle, respectively. Finally, to evaluate the effect of ROS in different mechanisms of regulated cell death, the role of autophagy, apoptosis and necroptosis was measured using spautin-1, Q-VD-OPH and necrostatin-1,respectively. Results show that AuNPs- Qts are cytotoxic in a dose-dependent manner in leukemia cells lines, while they showed low toxicity on PBMC. Additionally, they induced ROS production, which generated mitochondrial and nuclear damage and ROS dependent cell death. Finally, the results also show that cell death induced by AuNPs-Qts is dependent in the type of leukemic cell line, as they induce apoptosis in CEM and necroptosis in K562. These results open the doors to future studies to test efficiency in vivo, in addition to the possibility of coupling the AuNPs-Qts with other agents aiming at the simultaneous activation of different cell death pathways to overcome cell death resistance.