Expresión, purificación y caracterización de proteínas quiméricas de la proteína sensorial RsbP de bacillus subtilis y la enzima diguanilato ciclasa. - Barahona Munguía, Claudia Jeannette (2016)
Propósito y Método del Estudio: Los dominios Per-ARNT-Sim (PAS) son módulos sensoriales y de interacción versátiles en la transducción de señales que les permiten a los organismos adaptarse a cambios en su ambiente externo. Nuestra hipótesis es que el dominio PAS de RsbP de Bacillus subtilis forma estructuras cuaternarias definidas con el dominio de respuesta diguanilato ciclasa, en presencia de un bucle enrollado o de un dominio PAS alternativo. Nuestro objetivo es determinar la estructura cuaternaria por medio de cromatografía de filtración en gel de proteínas quiméricas que contengan diferentes combinaciones de RsbP-PAS, diguanilato ciclasa y diferentes estructuras de unión entre ambos dominios. Contribuciones y Conclusiones: En el presente estudio se logró el diseño, expresión y purificación de tres proteínas quiméricas con diferente combinación del dominio sensorial PAS de RsbP de B. subtilis (RsbP-PAS) y el dominio de respuesta diguanilato ciclasa, también se modificó el tipo de unión entre los dominios: bucle enrollado por un dominio PAS completo y distinto a RsbP-PAS, verificando así la contribución del bucle o del dominio PAS a la estructura cuaternaria. Las proteínas quiméricas fueron clonadas y expresadas en el vector pGEX-4T-2 que contiene la secuencia que codifica para la proteína de fusión glutatión S-transferasa (GST), esto facilitó las etapas de purificación mediante cromatografía por afinidad y finalmente se determinó su estructura cuaternaria por medio de cromatografía de exclusión por tamaño. Los resultados obtenidos indican que la quimera 1: RsbP-PAS asociado a un dominio PAS alternativo, mostro una proteína de entre 31-34 kDa, consistente con monómero. La quimera 2: RsbP-PAS, el bucle enrollado de Bacillus subtilis y el dominio de respuesta GGDEF, mostró una proteína de entre 74-76 kDa lo que indica la formación de un dímero. La quimera 3: RsbP-PAS, un dominio PAS alternativo, el bucle enrollado de Bacillus subtilis y el dominio GGDEF, muestra una proteína de entre 46-47 kDa consistente con la formación de un monómero. Los resultados obtenidos nos muestran como los dominios PAS pueden presentar diferentes estructuras cuaternarias como lo establecimos en nuestra hipótesis, estos cambios en las proteínas oligoméricas originados en un dominio PAS se pueden propagar a través de la interface entre el dominio PAS y el dominio de respuesta permitiendo la interacción entre los dominios.