Generación de un vector adenoviral para marcaje fluorescente selectivo de células tumorales - Robles Zamora, Alejandro (2013)
Introducción: Las células tumorales circulantes (CTC) son células que se originan de tumores primarios o de eventos metastásicos y que circulan libremente en el torrente sanguíneo de pacientes. Una de sus características más relevante es su capacidad ilimitada de división o inmortalidad. La expresión del gen de la transcriptasa reversa de telomerasa humana (hTERT), la enzima que mantiene la longitud de los telómeros, está desregulada en el 85-90% de las células tumorales. El uso de promotores tejido-específicos restringe la expresión génica o replicación viral a tejidos específicos. En este caso, el promotor de hTERT, altamente activo en la mayoría de las células tumorales, particularmente de cáncer colorrectal (CCR) como se mencionó previamente pero inactivo en células somáticas normales, resulta un candidato de promotor tejido-específico óptimo, por lo que su uso acoplado con proteínas fluorescentes mediante un vector adenoviral permitiría la detección selectiva de CTC. Objetivo: Generar un vector adenoviral diseñado para inducir la expresión selectiva de la proteína roja fluorescente (RFP) en células tumorales mediante la transducción con el gen RFP bajo el control del promotor hTERT. Materiales y métodos: Plásmidos: pUC57-hTERT-RFP, pShuttle, AdEasy-1. Cepas bacterianas: E. coli TOP10F’, BJ5183. Línea celular: HEK293. Se construyó el genoma del vector adenoviral a partir de la secuencia comercial hTERT-RFP clonada en pUC57. Dicha secuencia fue subclonada en el plásmido acarreador pShuttle. Luego éste se recombinó con el plásmido AdEasy. Se caracterizó y transfectó en células HEK293 para producir las partículas virales Ad-hTERTRFP. El vector adenoviral se caracterizó por inmunohistoquímica, PCR y microscopía de fluorescencia. Resultados: Se observó el efecto citopático característico de la infección por adenovirus en células HEK293 y mediante microscopía de fluorescencia se pudo observar la expresión de la RFP en su citoplasma. Conclusiones: Se diseñó, construyó, generó y caracterizó un vector adenoviral portador del promotor hTERT que induce la expresión de RFP en células que expresan altos niveles de telomerasa.