Comparación de la actividad hemolítica y fosfolipásica A2 de Trichomonas vaginalis cultivada en presencia y ausencia de vitaminas 107 diamond - Rodríguez García, Jessica Lyssette (2014)
Trichomonas vaginalis es el agente causal de la tricomoniasis. Su mecanismo de patogenicidad de T. vaginalis aún se desconocen en su mayor parte, sin embargo se han asociado algunas actividades hemolíticas de fosfolipasas A con su capacidad invasiva, los cuales se constituyen como los principales factores de virulencia. Las fosfolipasas A son factores líticos, estos factores son conocidos como hemolisinas por sus propiedades biológicas que han sido estudiadas primeramente usando eritrocitos. T. vaginalis cuando crece en el medio PEHPS es indispensable suplementarlo con suero bovino, necesario para su crecimiento, otro suplemento son las vitaminas 107 de Diamond. Hasta la fecha, no existen reportes sobre la contribución de las vitaminas en la expresión y producción de los factores involucrados en virulencia de este protozoario. En este proyecto comparamos la actividad hemolítica y fosfolipásica A2 en las fracciones P30, S30 y Extracto Total a pH 8 de trofozoítos de Trichomonas vaginalis cultivados en presencia y ausencia de vitaminas, mediante la siguiente Metodología 1.- Utilizamos la cepa GT-15 de T. vaginalis en medio PEHPS-CV y PEHPS-SV, además de los cultivos masivos de tricomonas en suspensión. 2.- Elaboramos curvas de crecimiento de T. vaginalis cepa GT15 en presencia y en ausencia de vitaminas 107 de Diamond.3.- Obtuvimos la fracción Extracto total, fracción P30 y fracción S30 de la cepa GT-15 a pH 8 cultivada en PEHPS-CV y PEHPS-SV. 4.- Cuantificamos las proteínas mediante el método de Lowry. 5.- Obtuvimos los eritrocitos de Humano. 6.- Cuantificamos la actividad hemolítica, de las fracciones obtenidas en PEHPS-CV y PEHPS-SV en cuanto al tiempo y la dosis para obtener la dosis hemolítica 50 (DH50).Mediante la liberación porcentual de hemoglobina, a los eritrocitos les ajustamos los volúmenes de mezclas de ensayo con SSB (control negativo), con concentraciones de las fracciones: P30, S30 y ET obtenida en presencia o ausencia de las vitaminas 107 de Diamond. 7.- Determinamos la actividad Fosfolipásica tipo A2 de las fracciones P30, S30 y Extracto total en cuanto al tiempo y la dosis en PEHPS-CV y PEHPS-SV, utilizamos el método de radioensayo, separamos los lípidos mediante cromatografía en placa fina. Se determinó la radiactividad presente en las manchas y determinamos la radioactividad usando un espectrofotómetro de centelleo líquido. Encontrando que el máximo crecimiento es a las 48 horas de incubación con un inoculo de 5,000 trofozoítos/ml, observamos que no hay diferencia estadísticamente significativa entre la presencia y ausencia de vitaminas 107 de Diamond en el crecimiento de trofozoitos de Trichomonas vaginalis. Al incubar a 37 °C. por tiempos variables con 150 µg. de proteína total de P30, S30 y ET de PEHPS-SV y PEHPS-CV , encontramos que la liberación de [14C]AGL (correspondiente a la actividad fosfolipásica de tipo A2) se incrementó linealmente en función del tiempo de incubación. Alcanzando en ambos tratamientos 60 min como máxima actividad, mayores tiempos no produjo un aumento en dicha actividad. Es de llamar la atención que las fracciones ET, P30 y S30 obtenidos con vitaminas fue 1.84 veces más activo que el obtenido sin vitaminas. Encontramos que el ET, P30 y S30 con ambos tratamientos se incrementaron linealmente con respecto a diferentes concentraciones de proteína total entre 0 y 150 µG, donde observamos que las fracciones proveniente de PEHPS-CV fue 1.87 veces mayor en su actividad que las fracciones obtenidas del medio PEHPS-SV. Con las fracciones ET, P30 y S30 se encontró que la proteína obtenida del medio PEHPS-CV no presentó una fase Lag en su actividad hemolítica y su máxima liberación de hemoglobina fue a las 4.5 hr. Las fracciones obtenidas del medio PEHPS-SV presento una fase Lag de 1 hr , tiempos más largos se presentó una fase lineal alcanzando el 100% de hemoglobina liberada a las 6 hr de incubación