Evaluación del efecto de las proteínas estructurales y no-estructurales del VHC en la expresión de COX-2. - Salas Villalobos, Tanya Bernardette (2013)
Introducción: La Hepatitis C es causada por infección con el virus de la hepatitis C (VHC). En la actualidad no se conocen los mecanismos mediante los cuales el VHC modula la supervivencia celular. Se ha reportado un incremento en los niveles de ARNm de ciclooxigenasa-2 (COX-2) en células que expresan las proteínas virales, comparado con células que no tienen el replicón del VHC, sugiriendo que el VHC regula la transcripción de COX-2. Por lo que es importante elucidar la participación de COX-2 para determinar el mecanismo de acción por el cual las especies reactivas de oxígeno generadas por las proteínas virales activan la expresión de COX-2, la cual está relacionada con la supervivencia celular y tumoral. Objetivo: Evaluar la participación de las proteínas virales estructural (E2) y no-estructural (NS5A) del Virus de la Hepatitis C en la regulación de la expresión de COX-2. Materiales y Métodos: Se realizaron ensayos de sobreexpresión transitoria de las proteínas virales y se evaluó su efecto en dos líneas celulares de hepatocarcinoma (HuH-7 y HepG2). Se sembraron 200,000 células en placas de 6 pozos, posteriormente se realizó una primo-infección con vaccinia virus durante 1 hora antes de cada transfección. Los plásmidos pFK1, pNS5A y pE2 (0.5 µg y 1 µg) se transfectaron con lipofectamina y se extrajeron proteínas a los tiempos 0, 24, 36 y 48 h post-transfección. Posteriormente se realizó la cuantificación proteica por el método de Bradford y se realizó electroforesis en condiciones desnaturalizantes, determinándose la expresión de COX-2 por Western blot. Por otra parte también se evaluó el efecto de las proteínas virales en la expresión de COX-2 a nivel de transcripción, para lo cual se les extrajo ARN total por el método de trizol y se cuantificó por PCR en tiempo real usando sondas Taqman específicas para una región de la secuencia de NS5A y Sybergreen con cebadores específicos para NS5A y E2, y normalizadas con β- Actina y GAPDH. Se seleccionó el tiempo 36h para los ensayos de co-transfección con el plásmido pCOX-2 (0.1 µg y 0.5 µg) con cada uno de los plásmidos pFK1, pNS5A y pE2 (0.2 µg y 0.5 µg) y se llevaron a cabo los ensayos de Western blot y Q-PCR como se describieron anteriormente. Resultados: La regulación de COX-2 fue diferente en ambas líneas celulares. Sin embargo, se observó un incremento en la expresión de la proteína COX-2 en ambas líneas celulares transfectadas con pFK1, pNS5A y pE2 a las 36 h, por lo que se determinó el uso de este tiempo para los ensayos posteriores de Q-PCR y Western blot en la co-transfección de los plásmidos utilizados con pCOX-2. En el ensayo de cotransfección pFK1pCOX2 en las células HuH-7 se observó un incremento a nivel de transcripción de RNA-COX2 y RNAVHC como a nivel de traducción proteína-COX-2 cuando se cotransfectaron 0.2 µg de pCOX-2, esto en presencia del RNA viral. En cambio, en la línea celular HepG2 la cotransfección de pFK1pCOX2 resultó en un nivel de expresión menor a nivel de proteína-COX-2; los niveles de RNA-VHC resultaron menores que en HuH-7 y RNA-COX2 fue mayor que en HuH-7. En el ensayo de cotransfección pNS5ApCOX2 en HuH-7 el incremento de RNA-COX2 y RNA-NS5A así como el nivel de proteína-COX-2 fue directamente proporcional de acuerdo a la cantidad de plásmido utilizada, no así en HepG2 en donde el nivel de proteínaCOX-2 resulto en un nivel de expresión menor así como una disminución en el nivel de RNA-NS5A cuando se incrementó la cantidad de plásmido pCOX-2. En el ensayo de cotransfección pE2pCOX-2 en HuH-7 se observó una disminución del RNA-E2 en presencia de una sobreexpresión de COX-2, así como una disminución de la proteína-COX-2; a diferencia de lo encontrado en HepG2, en donde el nivel de RNA-E2 se incrementó en lacontransfección en comparación con el control de plásmido pE2, además el nivel de proteínaCOX-2 fue mayor en comparación con HuH-7. Conclusiones: La expresión de las proteínas virales en ambas líneas celulares HuH-7 y HepG2 resultó en un incremento en la expresión de la enzima COX-2, sugiriendo que la expresión de los genes del VHC regulan de manera diferencial la actividad de la transcripción de COX-2 en las 2 líneas celulares. El efecto de las proteínas NS del VHC en HuH-7 causó un incremento de la proteína COX-2 en comparación con HepG2. El efecto de NS5A del VHC en HuH-7 causó un incremento de la proteína COX-2 en comparación con HepG2. El efecto de E2 del VHC en HuH-7 causó una disminución de la proteína COX-2 en comparación con HepG2. Se demostró que cada una de las líneas celulares regula de manera diferencial las vías de señalización de COX-2 como respuesta a la presencia del VHC.