Efecto patológico de la expansión de poliglutaminas de hTBP en la enfermedad neurodegenerativa SCA17 en Drosophila melanogaster - Cárdenas Tueme, Marcela (2017)
Las ataxias espinocerebelosas (SCAs) son trastornos progresivos en los que el cerebelo y el tronco cerebral se degeneran lentamente. El síntoma principal de las diversas SCAs que existen es el patrón de neurodegeneración cerebelar que los pacientes exhiben. La ataxia espinocerebelosa 17 (SCA17) también conocida como enfermedad de Huntington-4 (HDL4), es causada por una expansión del trinucleótido CAG/CAA en las regiones polyQ del gen que codifica al factor transcripcional TBP humano (hTBP). El umbral fisiológico de las glutaminas totales presentes en hTBP es de alrededor de 30 a 40 repeticiones y un número mayor de 40 causa la patología. En esta tesis analizamos el efecto neuropatológico de hTBP con la región polyQ expandida (80Q) modelado en D. melanogaster. La estrategia experimental consistió en la generación de las moscas transgénicas para dirigir la expresión específica de hTBP34Q y 80Q en el cerebro y en los ojos de Drosophila. La agregación de proteínas en el cerebro de las moscas se determinó mediante inmunofluorescencia y la muerte celular fue evaluada utilizando el ensayo TUNEL. Para determinar el estado de la marcha de las moscas que expresaban hTBP34Q y 80Q en el cerebro se realizó la prueba de escalada en moscas adultas. Los resultados obtenidos mostraron exitosamente la expresión especifica de tejido de hTBP 34 y 80Q en el cerebro y ojos de Drosophila usando los promotores ELAV y GMR respectivamente. La expresión de hTBP34 y 80Q causó fenotipos aberrantes en el ojo de Drosophila. Así mismo, la expresión de hTBP80Q en el cerebro mostró ser neurotóxica acortando el tiempo de vida de las moscas. Las imágenes confocales mostraron que la agregación de hTBP34Q y 80Q en el cerebro de Drosophila es dependiente de la edad de las moscas y del tamaño de la expansión, donde los agregados de hTBP80Q mostraron un incremento de los 2 a los 20 días. La expresión de hTBP 34 y 80Q provocó muerte neuronal dependiente de la edad y las moscas hTBP80Q fueron severamente afectadas en las pruebas de escalada. Estos resultados permitieron concluir claramente el efecto neurotóxico de hTBP80Q en el cerebro de la mosca que acortó su tiempo de vida y capacidad locomotriz debido a la formación de los agregados proteicos y muerte celular por lo que abren la posibilidad para evaluar el tipo de muerte celular producida en las neuronas afectadas y el comportamiento molecular de estas expansiones polyQs en las patologías neurodegenerativas como SCA17. SUMMARY Spinocerebellar ataxias (SCAs) are progressive disorders in which the cerebellum and the brain stem slowly degenerate. We modeled spinocerebellar ataxia 17 (SCA17) in Drosophila melanogaster, also known as Huntington-4-like disease (HDL4). SCA17 is caused by an expansion of the CAG / CAA trinucleotide in the gene encoding polyQ regions in the human TBP protein (hTBP). The physiological threshold of the total glutamines present in non-pathological TBP is around 30 to 40 repetitions and a greater number of 40 causes the pathology. To analyze the neuropathological effect of hTBP with the extended polyQ (80Q) compared with wild type hTBP (34Q) using D. melanogaster as a model. Our experimental strategy consisted of addressing specific expression of hTBP with polyQ expansions of 34Q and 80Q using the eye driver GMR-GAL4 to evaluate eyephenotype toxicity due to these polyQ expansions. Then, we used ELAV-GAL4 to address hTBP34 and 80Q to the flies’ brain and measure protein aggregation, cell death and climbing ability. Protein aggregation in the flies’ brain was measured by immunofluorescence; cell death was evaluated using TUNEL and climbing test in adult flies were compared between 34Q and 80Q. Our results, showed that hTBP34 and 80Q expressed in the flies’ eyes caused an aberrant phenotype which was polyQ lengthdependent as well as age-dependent. hTBP80Q expression in the flies’ brain shortened its life span when compared with the control groups. Confocal images of the flies’ brains expressing hTBP34 and 80Q, showed that protein aggregation from hTBP80Q occurred from day 2 to day 20, and, hTBP34Q started aggregating at day 50. Expression of hTBP34 and 80Q caused neurodegeneration, hTBP80Q triggered more neuronal death than hTBP34Q. When testing climbing ability, hTBP80Q flies were severely affected when compared with the rest of the groups in the RING test. These results let us conclude that hTBP34 and 80Q are neurotoxic, form protein aggregates, cause neurodegeneration and affect the climbing ability of Drosophila melanogaster. We expect to complement these results with further experiments and analyze these polyQ expansions in additional models.