Respuesta antioxidante de Yarrowia lipolytica en ausencia del gen CAT3 - Quiñones González, Clara Alicia (2018)
El estrés oxidativo (EO) es un desequilibrio entre especies reactivas de oxígeno y la actividad de moléculas antioxidantes. En Y. lipolytica (Yl) se han identificado 6 genes que codifican para enzimas de la respuesta antioxidante; de éstos, el gen CAT3 es el que presenta los mayores cambios de expresión frente al EO, lo cual sugiere que la enzima codificada por este gen participa en la primera línea de defensa antioxidante en esta especie. Considerando lo anterior, en el presente trabajo se generó una cepa mutante de Y. lipolytica por deleción del gen CAT3, con la intención de tener una cepa con una respuesta antioxidante disminuida. La secuencia del gen CAT3 se identificó en el genoma de Y. lipolytica (YALI0F30987g). La construcción del cassette de disrupción (CAT3-URA3-CAT3: 2878 pb), se realizó mediante la técnica de Double-Joint PCR y se integró por recombinación homóloga en el genoma de células litio competentes de Y. lipolytica. Las putativas mutantes se seleccionaron en base a su auxotrofía y la deleción del gen CAT3, la inserción del cassette de disrupción en la orientación y locus correcto se comprobó por PCR y por digestión enzimática. Finalmente, las mutantes Ylcat3-Δ se sometieron a un análisis fenotípico. La cepa mutante Ylcat3-Δ no mostró cambios en su dimorfismo, creciendo en forma de micelio o de levadura en respuesta a la fuente de nitrógeno presente en el medio de cultivo. La morfología de las colonias fue similar al de la cepa parental y únicamente se observaron cambios en el tamaño de las colonias de la cepa mutante Ylcat3-Δ cuando las células se cultivaron en presencia de H2O2. Aunque en el análisis cualitativo se observó una disminución del crecimiento de la cepa mutante Ylcat3-Δ en presencia de H2O2 (5 mM), el análisis cuantitativo demostró que la cepa mutante Ylcat3-Δ presenta un crecimiento similar al de la cepa parental bajo condiciones normales y en presencia de H2O2. Los resultados indican que la deleción del gen CAT3 no modifica la respuesta antioxidante de Y. lipolytica al EO ocasionado por H2O2 posiblemente debido a que otros mecanismos implicados en la respuesta antioxidante estén ejerciendo un efecto compensatorio que protege a la célula del daño oxidativo provocado por el H2O2. ABSTRACT The oxidative stress defined as an unbalance between the production of reactive oxygen species and antioxidant defense. They have identified 6 antioxidant defense genes in Yarrowia lipolytica (Yl), of these CAT3 gene presents the highest expression levels as a response to oxidative stress suggesting its participation in the antioxidant defense first line in this specie. Hence, the aim of the present work was to generate a catalase 3 deficient mutant of Y. lipolytica (Ylcat3-Δ) with the intention to obtain a deficient strain in its antioxidant defense response. The sequence of the CAT3 gene was identified in Y. lipolytica genome (YALI0F30987g). The disruption cassette construction (CAT3-URA3-CAT3: 2878 pb) was generated by Double joint PCR (DJ-PCR) technique, the genetic construction was inserted via homologous recombination in lithium competent cells genome of Y. lipolytica. The auxotrophy and the CAT3 gene deletion were used for the mutant cell selection, besides PCR and restriction enzyme reactions showed the integration of disruption cassette at the correct locus. The Ylcat3-Δ mutant were analyzed phenotypically. The dimorphism of Ylcat3-Δ mutant was not affected by nitrogen source, used in the growth medium. In addition, its colony morphology was similar to the wild type, and only the size of the Ylcat3-Δ mutant colony was modified in presence of H2O2. Although, in the qualitative analysis observed a decrease in the Ylcat3-Δ mutant growth in presence of H2O2 (5 mM), the quantitative analysis showed that Ylcat3-Δ mutant has the same growth rate that the wild type under normal conditions and in presence of H2O2. This suggest that in absence of the CAT3 gene other mechanisms of the antioxidant defense protect the cell of oxidative damage induced by H2O2.