Antimicrobianos naturales sobre la viabilidad, movilidad tipo swarming y formación de biopelículas en patotipos de E. coli. - Gil Solís, Carolina Eugenia (2018)
Escherichia coli es una bacteria que está presente de forma natural en la microbiota intestinal de animales de sangre caliente; sin embargo, existe un subconjunto de cepas con capacidad de causar infecciones entéricas en humanos. La seguridad y la calidad microbiológica de los alimentos se han convertido en un desafío para la industria alimentaria. En la actualidad la búsqueda de antimicrobianos derivados de plantas que inhiban bacterias de interés alimentario y brinden alternativas al uso de conservadores sintéticos se ha incrementado. En este contexto, los fitoquímicos del tipo polifenol se han reportado como alternativas ideales para ese propósito a debido a su capacidad antimicrobiana. En este trabajo se evaluó la actividad de compuestos polifenólicos sobre el crecimiento, la viabilidad, la motilidad swarming y el índice de formación de biopelícula (IFB) en patotipos de E. coli (EPEC, EHEC y ETEC). Se determinaron concentraciones mínimas bactericidas (CMB) de ácido tánico (AT), ácido gálico (AG), metil galato (MG) y galato de epigalocatequina (EGCG) mediante el método de microdilución en placa. El efecto de concentraciones sub-inhibitorias (CS) sobre el crecimiento y la viabilidad se evaluó mediante el método de la placa vertida y la integridad de la membrana mediante citometría de flujo. La motilidad swarming se determinó en agar suave LB. El IFB se determinó por un método colorimétrico. Mediante el sistema qPCR SYBR Green Supermix se evaluó la expresión relativa de genes asociados a la motilidad swarming (flhC, fliA y fliC) y genes asociados a la formación de biopelículas (csgA, csgD y cyaA). El rARN 16S (un gen constitutivo) se usó para normalizar y comparar los niveles de expresión de genes diana detectados entre cepas tratadas y control (no tratadas), midiendo los cambios en la expresión del número de veces usando el método delta Ct. Se encontró que las CMBs de compuestos polifenólicos contra los tres patotipos de E. coli, estuvieron en rango de concentración de 80-2500 μg/ml. El MG fue el más potente para inhibir el crecimiento de todas las bacterias probadas (80-600 μg/ml), mientras que el AT fue el que menos (1800-2400 μg/ml). EPEC fue la cepa más susceptible (80-2100 μg/ml), mientras que ETEC fue la cepa más resistente (600-2400 μg/ml). Las CS de los XII compuestos no afectaron la viabilidad bacteriana según crecimiento en placas de agar. Todas las CS de los compuestos redujeron la motilidad swarming entre un 20% a 100%. Ambas CS de AT mostraron 100% de reducción y AG a 1250 μg/ml logró más del 90% de reducción en EHEC y ETEC; mientras que en EPEC este ensayo no se llevó a cabo por tratarse de una cepa no móvil. AG a 1250 μg/ml produjo el mayor efecto en la reducción del IFB en EPEC, EHEC y ETEC. Los resultados de la expresión relativa de genes mostraron que AG a 1250 μg/ml está actuando positivamente en la represión del sistema de genes curli pero no así en el sistema flagelar, aun cuando se haya encontrado disminución en swarming. TA indujo el aumento en el valor de IFB en EPEC, así también MG y EGCG incrementaron el IFB en EHEC y ETEC. En general, todos los polifenoles mostraron actividad bactericida contra los tres patotipos de E. coli, sin embargo las CS tuvieron diferentes efecto sobre swarming y biopelículas (positivo o negativo). AG a la CS de 1250 μg/ml fue el compuesto que simultáneamente tuvo el mayor efecto positivo contra la disminución de la motilidad swarming y formación de biopelículas en los tres patotipos de E. coli, en tanto que los demás compuestos afectaron la expresión de estos factores de virulencia en grado variable. ABSTRACT Escherichia coli is a bacterium that is normally present in the intestinal microbiota of warm-blooded animals; however, there is a subset of strains capable of causing enteric infections in humans. The safety and microbiological quality of food has become a challenge for the food industry. Currently, the search for antimicrobials derived from plants that inhibit bacteria of food interest and provide alternatives to the use of synthetic preservatives has increased. In this context, phytochemicals such as polyphenolic compounds have been reported as good alternatives for that purpose due to their antimicrobial capacity. In this work we evaluated the activity of polyphenolic compounds on growth, viability, swarming motility and biofilm formation index (BFI) in E. coli pathotypes (EPEC, EHEC and ETEC). Minimal bactericidal concentrations (MBC) of tannic acid (TA), gallic acid (GA), methyl gallate (MG) and epigallocatechin gallate (EGCG) were determined by the microdilution method. The effect of subinhibitory concentrations (SC) on growth and viability was assessed by the spiked plate method and the integrity of the membrane by flow cytometry. The swarming motility was determined in soft agar LB. The BFI was determined by a colorimetric method. The qPCR SYBR Green Supermix system was used to evaluate the relative expression of genes associated with swarming motility (flhC, fliA and fliC) and genes associated with the formation of biofilms (csgA, csgD and cyaA). The 16S rRNA, a constitutive gene, was used to normalize and compare the expression levels of target genes detected between treated and control strains (untreated), by measuring changes in the number of times expression using the delta Ct method. It was found that the MBC of polyphenolic compounds against the three E. coli pathotypes were in the concentration range of 80-2500 μg/ml. The MG was the most potent to inhibit the growth of all the bacteria tested (80-600 μg/ml), whereas the TA was the least (1800-2400 μg/ml). EPEC was the most susceptible (80-2100 μg/ml), while ETEC was the most resistant (600-2400 μg/ml). The SC of the compounds did not affect the bacterial growth. All the compounds in SC reduced the swarming motility between 20% to 100%. Both AT CS showed 100% reduction and AG at 1250 μg/ml XIV achieved more than 90% reduction in EHEC and ETEC; while in EPEC this test was not carried out because it is a non-mobile strain. GA at 1250 μg/ml produced the greatest inhibitory effect on the BFI for EPEC, EHEC and ETEC. The results of the relative expression of genes showed that AG at 1250 μg/ml is acting positively in the repression of the curli gene system but not in the flagellar system, even though a decrease in swarming has been found. TA induced an increase in the BFI in EPEC, while MG and EGCG increased the BFI in EHEC and ETEC. In general, all polyphenols showed bactericidal activity against the three E. coli pathotypes; however, SC had different effects on swarming and biofilms (positive or negative). AG at 1250 μg/ml was the compound that simultaneously had the greatest positive effect against the decrease in swarming motility and biofilm formation in the three E. coli pathotypes, while the other compounds affected the expression of these virulence factors to a variable degree.