Selección de genes especie específicos de Mycobacterium tuberculosis expresados en condiciones de estrés térmico como candidatos para el diagnóstico de la tuberculosis. - Zenteno Chávez, Wendy Lilian (2018)
La tuberculosis es una enfermedad bacteriana ocasionada por especies agrupadas en el complejo Mycobacterium tuberculosis, es una de las principales causas de muerte en el mundo. La rapidez, precisión y sensibilidad de los métodos de detección de la presencia del bacilo son uno de los puntos esenciales para el control de la enfermedad. M. tuberculosis aumenta la expresión de ciertos genes en respuesta a diferentes condiciones ambientales a las que es expuesto. Para el desarrollo del presente trabajo se seleccionaron 8 genes (dnaK, groES, hspX, whiB3, whiB4, whiB5, whiB6 y whiB7), que de acuerdo a estudios previos y a una búsqueda bioinformática sobre el genoma de M. tuberculosis, muestran un incremento en sus niveles de expresión bajo condiciones de estrés térmico y pueden ser utilizados como candidatos para el posterior desarrollo de una herramienta diagnóstica, debido a su alta especificidad en el genoma de M. tuberculosis. Se diseñaron los iniciadores correspondientes para la amplificación por PCR de cada gen; la cepa H37Rv de M. tuberculosis fue incubada a temperaturas de 42, 45, 48 y 50 ºC durante 0.5, 1, 1.5 y 2 horas, posteriormente se llevó a cabo la extracción de RNA y síntesis de DNAc; la amplificación de los fragmentos de cada gen fue visualizada por electroforesis en gel de agarosa. Todas las muestras contenían la misma concentración inicial de RNA, por lo que una mayor intensidad de la banda indicó un incremento de la expresión del gen. El gen dnaK mostró una mayor intensidad de bandas a 42 y 48 °C a 30 min, whiB3 a 42°C a 30 min, mientras que whiB4 y whiB5 a 48°C entre 0.5 y 2 h de incubación en condiciones de estrés. Los genes groES, hspX, whiB6 y whiB7 no mostraron cambios evidentes en la intensidad de las bandas. En general todos los genes analizados disminuyen su expresión con el tiempo de exposición al estrés y en temperaturas más altas. Un estudio cuantitativo confirmaría los resultados obtenidos en este trabajo. Los genes dnaK, whiB3, whiB4 y whiB5 son candidatos para continuar explorando su potencial como blancos de diagnóstico en una técnica de fácil implementación en laboratorios con infraestructura básica. ABSTRACT Tuberculosis is a bacterial disease caused by species belonging to the Mycobacterium tuberculosis complex, is one of the top 10 causes of death worldwide. Fast, precise and sensitive methods to detect the bacilli are essential for disease control. Mycobacterium tuberculosis increases expression of certain genes as a response to different environmental conditions. In the present work and based on previous studies about heat shock protein and a bioinformatic search, we selected 8 genes (dnaK, groES, hspX, whiB3, whiB4, whiB5, whiB6 y whiB7) which increase their expression under heat shock stress. Moreover, as they are specific to M. tuberculosis complex, they could be candidates to the development of a diagnostic tool. M. tuberculosis H37Rv strain was exposed to temperatures of 42, 45, 48 and 50 ºC for 0.5, 1, 1.5 and 2 hours. Then, bacteria were harvested and RNA isolation and cDNA synthesis were performed subsequently. End point PCR amplification was carried on with specific primers designed for each selected gene. Amplicons were visualized by agarose gel electrophoresis. All samples contained the same initial RNA concentration, therefore a higher band intensity indicated an increase in gene expression. dnaK gene showed a increased intensity band at 42 and 48 ºC at 30 min, whiB3 at 42 ºC and 30 min, while whiB4 and whiB5 at 48ºC between 0.5-2 h incubation in stress conditions. groES, hspX, whiB6 y whiB7 did not show evident changes in the intensity of bands. Regularly, expression levels of all genes decreased at longer exposure time to heat shock stress and at higher temperatures. A quantitative study will confirm the results obtained in this work. The genes dnaK, whiB3, whiB4 and whiB5 are candidates to continue exploring its potential as diagnostic targets as a easy implementing technique in laboratories with basic infrastructure.