Interacciones moleculares proteína-proteína de ANTP con el factor TFIIE-β a través de los residuos 32 y 36 del homeodominio - Altamirano Torres, Claudia Dalila (2014)
Las homeoproteínas contienen el homeodominio (HD) que actúa como dominio de unión al DNA y así mismo participa en interacciones proteína-proteína que intensifican la especificidad de unión. La homeoproteína Antennapedia (Antp) es responsable de la formación de segmentos torácicos y de la cabeza. El motivo de unión proteína-proteína YPWM liga a Antp a la maquinaria basal transcripcional ya que interactúa con el factor transcripcional BIP2. Estudios realizados en el laboratorio mostraron que Antp interacciona con el factor transcripcional TFIIE-β y que la hélice II del HD está involucrada en esta interacción (Cárdenas-Chávez 2012). Como los residuos 32 y 36 de la hélice II del HD se encuentran expuestos en la hélice II y están conservados en Antp y otras homeoproteínas, el objetivo de ésta tesis consistió en determinar si éstas posiciones están involucradas en la interacción molecular proteína-proteína Antp-TFIIEβ. Para ello, se realizó mutagénesis sitio-dirigida de los residuos 32 y 36 de la hélice II de Antp y se determinó su efecto en la interacción proteína-proteína con TFIIE-β mediante Fluorescencia por Complementación Bimolecular (BiFC) y activación de la transcripción. Los resultados de BiFC mostraron una considerable disminución de la interacción molecular en células transfectadas con las mutantes AntpI32L (29%), AntpI32A (31%), AntpH36R (23%) y AntpH36A (25%) con TFIIE-β. Las mutantes dobles de los residuos 32 y 36 mostraron una drástica reducción del porcentaje de interacción con TFIIE-β correspondientes al 11% con AntpI32L-H36R y 12% con AntpI32A-H36A. La falta de interacción de Antp con TFIIE-β debido a la mutación de los residuos I32 y H36 en la hélice II recuperó la actividad transactivadora de Antp en cultivo celular ya que no mostró efecto significativo en ausencia y presencia de TFIIE-β. Estos resultados en conjunto indican que los residuos 32 y 36 de la hélice II del HD de Antp están involucrados directamente en la interacción proteína-proteína con TFIIEβ y rescataron la actividad transcripcional de Antp en los sitios blanco de unión al DNA. El análisis de interacción molecular contribuye al conocimiento de los procesos de regulación génica de homeoproteínas mediante interacciones proteína-proteína con factores generales de transcripción como TFIIE-β que requieren ser verificados in vivo en Drosophila para determinar cómo contribuyen a la especificidad funcional. - 7 - 2. ABSTRACT